Хроматографические методы анализа

Данные методы описаны в следующих главах "Хроматографические методы анализа", "Адсорбционная хроматография", "Распределительная хроматография", "Осадочная хроматография", "Газовая хроматография" и "Тонкослойная хроматография".

Определение содержания раффинозы в мелассе

На лист хроматографической бумаги длиной 30-40 см на расстоянии 5 см от края (стартовая линия) наносят капиллярной трубочкой каплю раствора мелассы с содержанием сухих веществ 20%. Объем капли не должен превышать 0,001 мл. Рядом по той же стартовой линии наносят капли растворов раффинозы различной концентрации (0,5; 1; 1,5% и т.д.). Бумагу с нанесенными каплями высушивают и помещают в герметическую камеру. На дно камеры наливают растворитель (н-пропанол - этилацетат - вода в соотношении 7:1:2) и закрепляют так, чтобы самый край листа, около которого расположена стартовая линия, был погружен в растворитель. Камеру плотно закрывают и оставляют на сутки.

За это время растворитель, всасываясь, поднимается по листу бумаги почти до верхнего края, унося из нанесенного пятна раствора мелассы различные составные части ее на разную высоту. Затем лист бумаги извлекают, высушивают, опрыскивают его равномерно из пульверизатора 1%-ным спиртовым раствором а-нафтола (к которому предварительно прибавляют 10% по объему ледяной фосфорной кислоты), после чего нагревают 3-4 мин в сушильном шкафу при 90° С; при этом а-нафтол окрашивает пятна углеводов в фиолетовый цвет. Ближе к стартовой линии располагается сравнительно слабое пятно раффинозы. Далее располагается быстрее движущаяся сахароза, которая дает более крупное и яркое пятно, так как содержание ее в мелассе значительно больше, чем раффинозы. Капли растворов чистой раффинозы дают пятна на том же расстоянии от стартовой линии, что и раффиноза мелассы. Яркость и размер этих пятен сравнения различны, так как в нанесенных каплях содержалось различное количество раффинозы. Выбирая, какое из этих пятен сравнения больше приближается к раффинозному пятну мелассы, находим приближенно количество раффинозы в мелассе.

Н.П. Силина разработала ускоренный хроматографический метод определения раффинозы в мелассе. Для определения на листике хроматографической бумаги проводят посередине вертикальную линию и на расстоянии 1,5-2 см от нижнего края - горизонтальную линию, на которой наносят каплю 20%-ного раствора мелассы. Рядом по той же стартовой линии наносят капли растворов раффинозы различной концентрации 0,5; 1; 1,5% и т.д.

В качестве хроматографической камеры используют химический стакан диаметром 4-5 и высотой 8-10 см, прикрытый двумя стеклами. На дно стакана наливают растворитель (н-пропанол - этилацетат - вода в соотношении 7:1:2). Бумагу вставляют в стакан так, чтобы нижний конец ее на 5-7 мм погрузился в растворитель, а верхний зажимают между стеклами, которыми прикрыт химический стакан. Длина бумаги должна быть такой, чтобы край ее выступал над стеклом на 3-4 см. Через 2-3 ч хроматограмму вынимают, высушивают при комнатной температуре, опрыскивают 1%-ным спиртовым раствором a-нафтола, к которому прибавлена ледяная фосфорная кислота (см. предыдущее определение). Затем, сравнивая яркость пятна раффинозы мелассы с пятнами сравнения, находят приближенно количество раффинозы в мелассе.

Этот ориентировочный метод можно превратить в строго количественный, если не проявлять пятно раффинозы а-нафтолом, а выстричь кусок бумаги, на котором оно находится, и из этой полоски извлечь раффинозу 5-10 мл воды; 2 мл полученного раствора смешивают с 2 мл антронового реактива (0,2%-ный раствор антрона в концентрированной серной кислоте) и нагревают в течение 10 мин в кипящей водяной бане; раффиноза дает с антроном голубое окрашивание. Сравнивая интенсивность полученной окраски с окраской стандартных растворов раффинозы (растворов определенной концентрации) в фотоколориметре, можно определить количество раффинозы.