Триптофан

Триптофан (а-амино-р-индолилпропионовая кислота) относится к незаменимым аминокислотам.

Триптофан (а-амино-р-индолилпропионовая кислота)

Помимо обязательного присутствия в полноценных белках триптофан и его производные входят в состав многих важнейших продуктов обмена, имеющих циклическое строение. Отсутствие этой кислоты или нарушение процессов ее синтеза приводит к тяжелым заболеваниям (пеллагра, диабет, туберкулез). Триптофан применяется как реагент в биохимических исследованиях, в небольших количествах он используется в животноводстве.

Продуцентами триптофана могут быть дрожжи (Candida utilis), бактерии (Е. coli, Вас. subtilis и др.).

Триптофан получают двумя способами. Первый предусматривает микробный синтез L-триптофана с помощью мутантов Е. coli и A. aerogenes, дефицитных по тирозину и фенилаланину. В общем виде последовательность превращений следующая: эритрозо-4-фосфат + фосфоеноилпировиноградная кислота > 7-фосфо-3-дезокси-D-арабиногептулозовая кислота > 5-дегидрохинная кислота > 5-дегидрошикимовая кислота > шикимовая кислота > хоризмовая кислота > антраниловая кислота > триптофан.

Основным промежуточным продуктом является шикимовая кислота, из которой через 5-фосфо-З-енолпирувилшикимовую кислоту образуется хоризмовая кислота. Эта стадия наиболее важна на пути синтеза тирозина, фенилаланина и триптофана.

Второй путь микробного синтеза L-триптофана - трансформация предшественника аминокислоты с помощью ферментных систем микроорганизмов до L-триптофана. В качестве предшественника используется антраниловая кислота. Дрожжи Candida utilis, синтезируя молекулу триптофана, освобождают клетки от вредного действия антраниловой кислоты, превращая ее сначала в индол, а затем с участием серина в присутствии пиридоксальфосфата - в триптофан.

Схема конденсации серина с индолом, разработанная А. Е. Браунштейном и М. М. Шемякиным, предполагает образование триптофана в присутствии фермента триптофансинтазы.

Механизм трансформации антраниловой кислоты в триптофан представлен на рис. 5.4.

Трансформация антраниловой кислоты в триптофан

Технология получения L-триптофана при помощи дрожжей Candida utilis шт. 295 разработана Институтом микробиологии АН СССР совместно с Институтом микробиологии им. А. Кирхенштейна АН Латвийской ССР.

Для получения посевного материала продуцент триптофана - дрожжи Candida utilis шт. 295 размножают на питательной среде следующего состава (в г/л): мелассы 104, мочевины 5,0, К2НРO4 0,1, MgSO4 0,05, СаСl2 0,1. pH среды 7,5-8,0. Культуру выращивают на качалке при температуре 28-30 °С в течение 24 ч, для чего стерильно переносят в колбы на 750 мл, содержащие по 100 мл питательной среды указанного состава. Через 24 ч выращивания биомассу дрожжей используют для засева производственных ферментаторов.

Производственная питательная среда имеет следующий состав (в г/л): мелассы 62,3, мочевины 5,0, К2НРО4 0,1, СаСl2 0,1, MgSO4 0,05. После стерилизации при 0,1 МПа (1 кгс/см2) в течение 30 мин питательную среду охлаждают до 30 °С и в стерильных условиях засевают посевным материалом, который содержит 5 г/л сухой биомассы.

На первом этапе дрожжи выращивают в ферментаторе 24 ч при интенсивной аэрации не менее 7 г 02/(л-ч). В качестве пеногасителя используют кашалотовый жир и различные кремнийорганические соединения (ПМС-200, А-154). На втором этапе через 24 ч роста в культуральную жидкость небольшими порциями добавляют антраниловую кислоту (5%-ный спиртовой раствор) и мочевину (50%-ный раствор). Уровень аэрации снижается вдвое - до 3-4 г O2/(л-ч). Через 4 ч после внесения антраниловой кислоты и мочевины добавляют 25%-ный раствор мелассы. Во время выращивания микроорганизма-продуцента антраниловую кислоту и мочевину вносят через каждые 6 ч, мелассный раствор - через каждые 12 ч. Культивирование длится 144 ч, выход триптофана составляет 6 г/л.

Из культуральной жидкости можно получить две формы препарата: кормовой концентрат триптофана и очищенный препарат L-триптофана. Для получения очищенного препарата триптофана используют фильтрат культуральной жидкости, а для кормовых целей получают кормовой концентрат, в который входит биомасса продуцента.