Питательные среды

Одним из основных факторов, влияющих на быстрый рост микроорганизмов и максимальный синтез ими различных биологически активных веществ, являются питательные среды. При подборе питательной среды следует учитывать ее полноценность, т. е. обоснованный и сбалансированный набор различных питательных соединений, необходимых микроорганизму для построения растущей клетки и синтеза конечного целевого продукта.

Для нормального роста и развития микроорганизмов в питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых формируется клетка. Многим микроорганизмам для роста в той или иной питательной среде необходим целый ряд дополнительных условий: определенные концентрации водородных ионов, окислительно-восстановительный потенциал среды, требуемые соотношения различных ионов. Некоторые микроорганизмы с нарушенными наследственными признаками (ауксотрофные мутанты) нуждаются в отдельных факторах роста, которые они сами синтезировать не могут: аминокислотах, пуринах, витаминах и др.

Для получения продуктов микробиологического синтеза в зависимости от микроорганизма-продуцента и технологии производства используются отличные по составу питательные среды. В одном технологическом процессе для получения и размножения посевного материала и для стадии производственного культивирования могут применяться питательные среды различного состава.

Основными компонентами питательной среды являются источники углерода и азота.

Углеродсодержащее сырье

Наиболее характерным углерод-содержащим сырьем являются углеводы. Углеводы - одна из важнейших составных частей питательной среды для выращивания микроорганизмов. Они используются для синтеза клеточных структур и одновременно служат источником энергии. Для промышленного биосинтеза наиболее часто применяют глюкозу или крахмал. В среды для культивирования вводят техническую глюкозу или маточник (гидрол), остающийся после выделения кристаллической глюкозы. Гидрол содержит да 50% редуцирующих сахаров (в пересчете на глюкозу).

При введении в среду технических продуктов их количество рассчитывают по содержанию редуцирующих веществ в пересчете на чистые углеводы. Так, в частности, поступают при использовании в составе сред гидролизатов различных отходов переработки сельскохозяйственного сырья (подсолнечная лузга, кукурузные кочерыжки, древесная щепа и др.).

Крахмал, на 96-97,5% состоящий из полисахаридов, которые образуют при кислотном гидролизе глюкозу, может быть использован теми микроорганизмами, которые способны к биосинтезу амилолитических ферментов.

Азотсодержащее сырье

Биосинтез многих биологически активных веществ осуществляют на питательных средах сложного, а зачастую непостоянного химического состава. В них различные источники азота могут быть представлены белками, пептидами или свободными аминокислотами. При промышленной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидролизаты дрожжей. Кукурузный экстракт содержит весь комплекс аминокислот, но их количественный состав может значительно изменяться от партии к партии. Примерный химический и аминокислотный состав кукурузного экстракта представлен ниже.

Белковыми веществами богата соевая мука. Она так же, как и кукурузный экстракт, содержит все распространенные аминокислоты, однако в основном они связаны в виде белков. При оценке природных веществ (соевая мука, кукурузный экстракт и т. п.) следует принимать во внимание, что их воздействие на направленный процесс обмена веществ микроорганизмов обусловливается не только наличием белков и аминокислот, но и присутствием наряду с ними углеводов, нуклеиновых кислот, жиров, микроэлементов, органических кислот и других соединений.

Из минеральных азотсодержащих веществ наиболее часто применяют аммонийные соли серной, соляной или азотной кислот. Как показала практика, сульфат аммония оказался пригодным для биосинтеза многих соединений.

В веществах, содержащих аммонийный азот, ион аммония находится в сочетании с анионом какой-либо кислоты, например серной или фосфорной. Потребность микроорганизмов в сере и фосфоре меньше, чем в азоте, поэтому при использовании азота в среде будут накапливаться анионы и будет повышаться кислотность среды. Во избежание этого в процессе культивирования микроорганизмов в среду добавляют мел или ведут подтитровку щелочью.

Влияние источников азота на биосинтез зависит непосредственно не только от самого источника азота, но и от общего состава среды. Существенное значение имеет соотношение количеств присутствующих в среде азота и углерода. Их дозировку необходимо регулировать в соответствии с оптимальными границами концентрации наиболее важных веществ для данной культуры. Для каждого штамма-продуцента эта величина будет различной.

Приготовление и стерилизация питательных сред

Для приготовления производственной питательной среды предварительно растворяют сахара и соли, тщательно суспендируют такие нерастворимые компоненты, как соевая мука или мел. Крахмалсодержащее сырье предварительно клейстеризуют. Для ускорения эти процессы проводят в небольших аппаратах с мешалками (реакторы), а затем растворы смешивают в закрытом смесителе-реакторе с плоским дном, снабженным барботажным устройством для ввода пара. Концентрат среды, составляющий около одной трети необходимого объема, для окончательного растворения и суспендирования нагревают острым паром до 70-80 °С. При этой температуре не происходит разложения термолабильных компонентов среды. Приготовление более концентрированных сред дает возможность использовать смесители меньшей вместимости.

Необходимое условие успешной стерилизации питательной среды - тщательная гомогенизация ее твердых компонентов. Длительность выдержки (при температуре стерилизации) крупных частиц, медленно прогревающихся при стерилизации, бывает меньше расчетной, и в них сохраняется посторонняя микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость.

Результаты исследований процесса перемешивания свидетельствуют о том, что скорость растворения вещества в жидкости пропорциональна мощности мешалки, приходящейся на единицу объема жидкости. В связи с этим реакторы для приготовления питательной среды должны быть снабжены достаточно мощными мешалками, а также перегородками-отражателями, не допускающими завихрения и вращения жидкости в аппаратах (табл. 2.1).

В табл. 2.1 приведены основные типы перемешивающих устройств и указаны области их применения. Состав используемых в производстве питательных сред обусловливает применение определенных типов перемешивающих устройств как в аппаратах для подготовки отдельных видов сырья (разбавление мелассы и клейстеризация крахмала), так и в самом реакторе (смесителе) для приготовления питательной среды. Если необходимо среду подвергнуть циклической стерилизации, то эту операцию можно осуществить в ферментаторе. При этом среда и оборудование стерилизуются одновременно (рис. 2.1).

На рис. 2.1 приведены возможные схемы нагрева и охлаждения ферментатора. Чаще всего используют комбинированный нагрев острым паром и через рубашку или змеевик. Для циклической стерилизации, как правило, установлено, что наиболее удобно и экономически выгодно поддерживать температуру 121 °С, что соответствует давлению насыщенного пара 100 кПа. В обычных условиях питательные среды выдерживают при температуре стерилизации от 30 до 40 мин. Полный цикл нагревания, выдержки и охлаждения для крупных ферментаторов (63 м3) исчисляется несколькими часами (рис. 2.2).

Метод циклической стерилизации среды в аппарате очень прост. Однако он имеет существенные недостатки по сравнению с непрерывным методом. Во-первых, ухудшается качество питательной среды из-за более длительного воздействия высокой температуры, чем при непрерывной стерилизации, что наглядно видно из рис. 2.2. Во-вторых, требуется повышенный расход пара в период нагрева среды, и, в-третьих, циклический процесс труднее поддается автоматизации. Поэтому в настоящее время его применяют для стерилизации среды только в аппаратах малого объема.

Тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Некоторые из них сводятся к разложению нестойких к нагреванию соединений, что приводит к потере необходимых для питания микроорганизма веществ. При других изменениях происходит взаимодействие различных компонентов среды, в частности между аммонийными или аминосоединениями и углеводами, что приводит к образованию продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. Большинство изменений химических ингредиентов среды возникает при температурах выше, чем температура стерилизации.

Следовательно, эффективная стерилизация в сочетании с минимальными изменениями среды может быть достигнута путем применения более высокой температуры, а также быстрого нагревания и охлаждения. В циклических системах это обеспечивается с помощью глухого пара, проходящего через змеевики или нагревающие рубашки, и с помощью острого пара, инжектируемого через штуцера для засева, подачи воздуха и взятия проб. В результате такого приема вся арматура, соединенная с ферментатором, стерилизуется проходящим острым паром. Обработка острым паром приводит к образованию конденсата. В связи с этим необходимо заранее учитывать разбавление среды конденсатом и вносить соответствующую поправку в пропись первоначально приготавливаемого состава среды. Тогда к концу стерилизации среда будет иметь необходимую концентрацию всех питательных компонентов. Если стерилизацию углеводов проводить отдельно, а затем добавлять их асептически к остальной заранее простерилизованной среде, то можно предотвратить реакцию между углеводами и другими составными компонентами среды. Те компоненты, которые в высшей степени чувствительны к воздействию тепла, также могут быть простерилизованы раздельно. При этом для стерилизации может применяться облучение или фильтрация через обеспложивающие фильтры.

Ранее нами были отмечены преимущества высокотемпературной кратковременной стерилизации как приема, позволяющего свести к минимуму ухудшение питательных качеств среды без снижения эффективности самой стерилизации. Такой прием наиболее результативно может быть реализован при использовании системы непрерывной стерилизации в потоке (рис. 2.3). Среда готовится в отдельной емкости 1, а затем насосом 2 прокачивается через установку для стерилизации в заранее простерилизованный ферментатор. Установка непрерывной стерилизации состоит из последовательно соединенных секций (аппаратов): нагревателя 3, выдерживателя 4 и холодильника 5. В такой системе можно применять более высокие температуры, чем те, которые могут считаться экономичными при циклической стерилизации. В результате продолжительность выдерживания среды при максимальной температуре резко сокращается, а периоды нагревания и охлаждения не превышают нескольких секунд (см. рис. 2.2).

Для среды, свободной от суспендированных твердых частиц, поддержание температуры на уровне 150-160 °С обеспечивает мгновенную стерилизацию. При этом химические изменения, которые происходят в среде, настолько несущественны, что ими можно пренебречь. Если в среде присутствуют твердые суспендированные частицы, то оптимальная для стерилизации температура должна иметь более низкое значение, поскольку требуется дополнительное время для проникновения тепла внутрь таких частиц. Это значение будет определяться природой суспендированных частиц, а также допустимой в каждом отдельном случае степенью начального изменения состава среды. Наиболее распространенной в таких случаях считается температура стерилизации, равная 135 °С, а длительность выдерживания от 5 до 15 мин. Во всех случаях непрерывной стерилизации охлаждение среды практически осуществляется в теплообменниках типа труба в трубе или в противоточных пластинчатого типа, а нагревание - путем инжектирования острого пара.

Различные типы секций, используемые в системе непрерывной стерилизации, представлены на рис. 2.4. Экономичное потребление пара может быть достигнуто включением в систему специальной регенеративной ступени для предварительного подогрева холодной нестерильной среды. Непрерывная стерилизация дает возможность воспроизвести одинаковую степень химических изменений среды при различных масштабах производства. Кроме того, на предприятии резко снижаются колебания в потреблении пара и воды.

К каждому из аппаратов системы стерилизации предъявляются различные технологические требования, и в зависимости от режима и масштабов производства конструкция каждого из этих аппаратов может быть неодинаковой.

Основное требование, предъявляемое к нагревателю, - быстрый нагрев до температуры стерилизации при наименьшей затрате пара.

Нагреватель (рис. 2.5) обычно представляет собой колонку, изготовленную из двух труб. Наружная труба является корпусом. Пар подается сверху по внутренней трубе 3 со щелевидными прорезями, через которые он поступает в среду, и за 10-15 с нагревает каждый объем ее. Питательная среда подается снизу через штуцер 4, нагретая среда до температуры стерилизации выходит через штуцер 2. Движение среды происходит по спирали благодаря наличию винтовых направляющих 1. При остановке колонки сброс конденсата проводят через патрубок5 при открывании крана 6. Аппарат отличается простотой и малыми размерами, но работа его сопровождается гидравлическими ударами при конденсации пара и потерей конденсата.

В струйном нагревателе интенсивная турбулентность потока среды и пара предотвращает гидравлические удары и отложение осадков.

Основное требование, предъявляемое к выдерживателю, - постоянство длительности пребывания в нем каждого объема среды при определенной температуре стерилизации. Чтобы продолжительность выдержки была постоянной, нестерильная среда, поступающая в аппарат, не должна смешиваться со стерильной средой, выходящей из него. Иными словами, выдерживатель должен работать по принципу полного вытеснения. На рис. 2.6 показан трубчатый выдерживатель (стерилизатор). Он имеет входной штуцер 1 и состоит из трех труб 2, соединенных последовательно переходными штуцерами 3. На выходной трубе установлен автоматический регулятор давления 5 в выдерживателе в соответствии с температурой стерилизации. Выдерживатель оборудован манометром 4 и термометрами 6. Для опорожнения труб предусмотрены пробки 7.

Холодильник - наиболее крупногабаритный и дорогой аппарат в системе непрерывной стерилизации. Температура среды поддерживается на нужном уровне с помощью водопроводной воды, которая циркулирует в рубашке, поэтому малейшее нарушение герметичности стенки, через которую происходит теплопередача, может вызвать инфицирование питательной среды.

Герметичной, хорошо сохраняющей стерильность конструкцией является двухтрубный теплообменник (типа труба в трубе) сварной конструкции (рис. 2.7). Для большей гарантии герметичности среда подается по внутренней трубе теплообменника. Теплообменник пластинчатого типа в отличие от двухтрубного более компактен. Он также отличается хорошей герметичностью, высоким коэффициентом теплопередачи, наряду с этим имеет большую поверхность теплообмена на единицу объема аппарата.