Методы уничтожения (стерилизации) микробов

В лабораторной практике при работе с микроорганизмами приходится постоянно принимать меры, чтобы посуда, питательные среды, металлические инструменты, используемые во время работы, не содержали микробов. Для этой цели применяют следующие методы стерилизации:

- стерилизацию перегретым паром под давлением;

- стерилизацию текучим паром;

- стерилизацию горячим воздухом;

- дезинфекцию.

Наилучшим способом стерилизации является обработка различных объектов перегретым паром в специальных аппаратах - автоклавах.

Автоклав и стерилизация перегретым паром под давлением

Автоклавы - это металлические (стальные, чугунные или медные) котлы с двойными стенками и массивной крышкой, герметически закрывающейся с помощью болтов и резиновой прокладки. В зависимости от системы обогрева автоклавы бывают паровые, электрические и огневые (рис. 42). Получение в автоклаве высокого давления и перегретого пара температурой 115-120°С позволяет в течение 20-30 мин уничтожить как вегетативные клетки, так и споры микробов.

В автоклаве стерилизуют все те предметы, которые не портятся при высокой температуре: различные жидкости (воду, питательные среды, не содержащие углеводных компонентов), стеклянную посуду, металлические инструменты, вату, марлю, бумагу и пр.

В тех случаях, когда некоторые вещества не выдерживают нормального режима стерилизации в автоклаве (в частности, питательные среды, содержащие сахара), их стерилизуют в автоклаве при температуре 112 °С в течение 20 мин, а также при более мягких режимах.

При высоких давлениях перегретого пара в автоклаве соответственно возрастает температура нагрева; это вызывает карамелизацию сахаров, добавляемых в некоторые питательные среды, в результате среды становятся непригодными для определения физиологических свойств микробов.

Измерение давления внутри автоклава производится с помощью манометра, вмонтированного в крышку или корпус автоклава. При чрезмерном возрастании давления автоматически срабатывает предохранительный клапан, расположенный в зависимости от конструкции либо на крышке, либо на боковой поверхности стенки автоклава. Струя пара, выходя со свистом из предохранительного клапана, предупреждает о необходимости прекращения нагрева. Если нагрев не прекратить, автоклав может взорваться.

В специальном кармашке на крышке автоклава иногда помещается термометр, с помощью которого измеряется температура стерилизации. Внутри автоклава имеется подставка, под которую наливается вода через трубку с воронкой, расположенную снаружи автоклава. Кроме того, автоклавы снабжаются краном для выпуска пара и воздуха и краном для выливания воды.

Правила обращения с автоклавом при стерилизации следующие: аппарат через воронку и трубку заполняют водой, уровень которой должен находиться ниже подставки. Предметы, подлежащие стерилизации, помещают в специальные металлические бюксы и загружают в автоклав. Крышку автоклава завинчивают.

Открыв кран для выхода пара и воздуха, начинают нагрев. Как только вода закипит, образующийся пар начинает вытеснять из автоклава воздух. Паровыпускной кран держат открытым до тех пор, пока из него сплошной струей не пойдет сухой пар. Это указывает на полное удаление воздуха из автоклава. Тогда кран закрывают. Пар, накапливающийся при дальнейшем нагревании все в большем и большем количестве, повышает давление в автоклаве, а вместе с тем и температуру. При работе с автоклавом можно руководствоваться таблицей соотношений между давлением пара и его температурой (табл. 4).

После того как стрелка манометра достигнет нужного показателя давления (температура в автоклаве при этом будет соответствовать принятой температуре стерилизации), регулируют нагрев автоклава так, чтобы давление держалось необходимое время на одном уровне. По окончании стерилизации прекращают нагревание. Когда температура в автоклаве понизится, а стрелка манометра опустится до нуля (давление в автоклаве сравняется с атмосферным), осторожно открывают паровыпускной кран, выпускают пар и, открыв крышку автоклава, вынимают материал. Открывать паровыпускной кран преждевременно, до падения давления в автоклаве, нельзя. Резкое понижение давления в камере автоклава вызовет бурное вскипание жидкостей, нагретых до более высоких температур, чем 100 °С, т.е. выше точки кипения при нормальном атмосферном давлении. Бурно вскипевшие жидкости будут смачивать или даже вытолкнут ватные пробки из сосудов - работа будет произведена впустую. Питательные среды будут портиться, так как на мокрых пробках легко развивается попадающая из воздуха микрофлора, проникает внутрь и заражает среды. Кроме того, открывать автоклав с повышенным давлением опасно для работника.

Однако как только стрелка манометра остановится на нуле, автоклав нужно открыть тотчас же, иначе конденсат начнет стекать на пробки и также вызовет их смачивание. Чтобы избежать смачивания пробок конденсационной водой, перед стерилизацией их закрывают бумагой.

Материалы, помещенные в автоклав, будут надежно простерилизованы за 20-30 мин, если температура поддерживается 120°С, что соответствует давлению в 2 ат (19,61 * 10000 н/м2) или по манометру в 1 ат сверх нормальной. Автоклав можно с успехом применять и для стерилизации сред текучим паром; в этом случае крышку автоклава не завинчивают.

Кипятильник Коха и стерилизация текучим паром

Кипятильник Коха представляет собой цилиндр из оцинкованной жести или меди с двойными стенками и конической крышкой в виде шлема (рис. 43). В крышке посредине имеется отверстие для термометра. Снаружи кипятильник Коха покрывают слоем теплоизолирующего материала: асбеста, линолеума и пр.

Внутри кипятильника помещена перегородка (подстава), разделяющая внутреннее пространство кипятильника на две секции: верхнюю и нижнюю. Нижняя секция заполняется водой, уровень которой устанавливается по водомерному стеклу: вода не должна покрывать верхней части подставы. В верхнюю секцию кипятильника в решетчатых ведерках, устанавливаемых одно на другое, помещают стерилизуемые предметы. Закрыв кипятильник крышкой, начинают нагревать в нем воду. Началом стерилизации считается момент, когда термометр покажет 98-100°С. При отсутствии термометра началом стерилизации считается момент, когда из отверстия в крышке кипятильника начнет энергично выходить пар. Таким образом, стерилизуемые предметы во время работы кипятильника будут все время находиться в струе текучего пара.

Метод стерилизации текучим паром благодаря его простоте и доступности широко распространен в лабораторной практике. Текучим паром стерилизуют главным образом питательные среды, у которых изменяются свойства при нагревании их выше 100°С: белковые, углеводные и желатиновые. Для этих сред метод стерилизации текучим паром наиболее приемлем.

Недостатком метода стерилизации текучим паром является его продолжительность, так как для полной стерилизации среды необходимо проводить многократное нагревание в кипятильнике в течение определенного времени - от 20 мин до 1,5 ч (в среднем 30-45 мин) в зависимости от объема жидкости с промежутками в 24 ч. Весь промежуток времени между нагреваниями среды рекомендуется выдерживать в термостате при 25-30 °С.

Однократное нагревание в кипятильнике Коха вызывает гибель лишь вегетативных микробных клеток, но споры при этом могут сохраниться. При выдерживании стерилизуемой питательной среды в благоприятных условиях (при комнатной температуре, а еще лучше в термостате) часть оставшихся спор прорастет и до следующего дня превратится в вегетативные клетки. Повторное нагревание вызовет гибель и этих вновь развившихся клеток. Наконец, третье нагревание через сутки выдерживания среды в термостате обеспечит полную стерильность. Такой метод получил название дробной стерилизации. В практической работе вместо стерилизации текучим паром в кипятильнике Коха часто применяют обычную стерилизацию в автоклавах при 112 °С с противодавлением 0,5 ат в течение 15-20 мин.

Сушильный шкаф и стерилизация горячим воздухом

В лабораторной практике для стерилизации микробиологической посуды необходимо иметь сушильный шкаф или так называемую печь Пастера. Принцип устройства сушильного шкафа и печи Пастера одинаков. Печи делаются только прямоугольной формы, а сушильные шкафы могут иметь не только прямоугольную, но и цилиндрическую форму (рис. 44 и 45). В этих аппаратах стерилизация осуществляется горячим воздухом (сухим жаром) при температуре 160 °С в течение 1 ч или при температуре 150 °С в течение 2 ч.

Как печи Пастера, так и сушильные шкафы - это полые внутри аппараты с двойными стенками, с двойными и плотно прикрывающимися дверцами. Снаружи для термоизоляции они покрываются слоем асбеста. Между стенками циркулирует горячий воздух, нагревание которого осуществляется либо электрическими спиралями, либо газовыми горелками. Внутри шкафа имеется несколько (обычно две или три) дырчатых полочек. В верхней части шкафа имеется два отверстия: одно предназначено для термометра, а второе служит для вентиляции. Наиболее удобны электрические сушильные шкафы.

В сушильных шкафах последней конструкции предусмотрены четыре ступени обогрева, которые могут быть включены в действие специальным регулятором, помещаемым на боковой стенке шкафа. Нужная степень обогрева достигается включением одной, двух, трех или всех четырех электрических спиралей, причем последовательность включения спиралей может быть любой.

В сушильных шкафах можно, кроме стеклянной посуды, стерилизовать марлю, вату, хотя все же лучше обрабатывать их в автоклаве, так как при температуре 160 °С они желтеют. Нельзя стерилизовать в сушильном шкафу резиновые изделия, так как они не выносят высокой температуры - становятся ломкими и портятся. Жидкости при 150-160 °С вскипают и меняют свой химический состав.

Чтобы избежать последующего заражения простерилизованных предметов микробами из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают в бумагу. Чашки Петри завертываются в бумагу по 2 штуки таким образом, чтобы в обертке не было щелей. Стеклянные трубки и пипетки также заворачивают в бумагу, сначала каждую отдельно, а затем в пачки по 10-20 штук. Заворачивание трубок и пипеток должно быть исключительно аккуратным, полностью предохраняющим их внешнюю поверхность от сообщения с воздухом. Колбы, пробирки, бутылки перед стерилизацией горячим воздухом закрывают ватными пробками и бумажными колпачками.

Нельзя допускать в сушильном шкафу повышения температуры выше 170 °С, так как при такой температуре ватные пробки буреют, а бумажные обертки становятся ломкими и даже обугливаются. Началом стерилизации считается момент, когда термометр покажет 150-160 °С. По прошествии требуемого для стерилизации времени нагревание прекращают. Чтобы предохранить посуду от растрескивания, стерилизовать нужно только сухую посуду и шкаф открывать после стерилизации лишь тогда, когда температура в нем упадет до 50-70 °С. Мелкие лабораторные предметы, например платиновые петли, иглы, пинцеты, ножницы и пр., можно стерилизовать простым прокаливанием на пламени газовой горелки (или спиртовки).

Дезинфекция

К дезинфекции в микробиологической лаборатории приходится прибегать очень часто. Наиболее употребительные дезинфицирующие вещества следующие: 3-5%-ный раствор карболовой кислоты и растворы других высших фенолов, 50-70%-ный раствор этилового спирта, такой же концентрации бутиловый спирт, 4%-ный раствор формалина, 1-2%-ные растворы хлороформа и толуола, 0,5%-ный раствор хлорамина и др.

В микробиологических лабораториях консервных заводов дезинфицируют поверхности столов, посуду, полы, стены помещений. Для дезинфекции поверхности столов можно использовать не только растворы этилового спирта, но и растворы карболовой кислоты.

Дезинфекция канализационных устройств на консервных заводах и других пищевых предприятиях производится 5-10%-ным раствором хлорной извести. Для обеззараживания оборотной стеклянной тары на консервных заводах применяют хлорную воду, содержащую в 1 л не менее 100 мг активного хлора. Для приготовления такого раствора берут хлорную известь, смешивают ее с небольшим количеством воды до получения густой массы молочного цвета. Эту смесь добавляют к воде, тщательно размешивают и оставляют на сутки. Хлорная известь реагирует с образованием гидрата окиси кальция - Ca(OH)2 - и активного хлора. Ca(OH)2 оседает на дно, раствор над осадком после осветления получается прозрачным, зеленоватого цвета. Замачивание тары в таком растворе длится 10 мин. После хлорирования тара должна быть тщательно промыта в проточной воде.