Бактериальные энтомопатогенные препараты
Бактериальные энтомопатогенные препараты занимают доминирующее положение среди микробных патогенов. Потенциально полезные энтомопатогенные микроорганизмы должны удовлетворять следующим требованиям.
1. Микроорганизм должен быть высоковирулентным для насекомого-мишени и не должен проявлять большую изменчивость.
2. Должен быть безопасным для всех других живых организмов, в том числе полезных насекомых, растений и позвоночных. Не должен поражать паразитов и хищников, нападающих на вид-мишень.
3. Должен быть экономичным при выращивании, выдерживать длительное хранение, не теряя жизнеспособности и вирулентности, чтобы можно было создать большие запасы.
4. Должен действовать быстро, чтобы насекомое до прекращения питания или гибели не успело нанести серьезного ущерба.
Многим из этих жестких требований отвечают бактериальные энтомопатогенные культуры.
В настоящее время бактериальные препараты используются для борьбы более чем со 160 видами вредных насекомых. Наиболее широко для получения энтомопатогенных препаратов применяется спорообразующая грамположительная бактерия Bacillus thuringiensis. Впервые она была выделена Берлинером в 1915 г. из больных гусениц мельничной огневки. Штаммы Bacillus thuringiensis кроме образования спор, вызывающих септицемию насекомого при попадании внутрь его тела, в процессе культивирования синтезируют ряд токсичных компонентов, которые могут накапливаться как в бактериальной клетке, так и в культуральной жидкости.
Токсичные продукты Bacillus thuringiensis
В соответствии с правилом называть токсины по порядку их открытия фосфолипаза С (лецитиназа С) была названа а-экзотоксином. Он является продуктом растущих клеток бактерий. Предполагается, что этот фермент вызывает распад незаменимых фосфолипидов в тканях насекомых, приводя их к гибели. Фосфолипаза С активна при pH кишечника в пределах 6,6-7,4 и повреждает у восприимчивых насекомых клетки кишечника, способствуя проникновению бактерий в полость тела.
Второй токсин - B-экзотоксин, или термостабильный экзотоксин, получил свое название за сравнительно хорошую стабильность при высокой температуре: активность сохраняется при автоклавировании в течение 15 мин при 121 °С. Токсин накапливается в культуральной жидкости, его образование совпадает с динамикой роста бактериальной культуры. В состав токсина входят аденин, рибоза и фосфор в соотношении 1:1:1. Предполагают, что молекула B-экзотоксина состоит из нуклеотида, сложно связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Действие B-экзотоксина, по-видимому, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, из-за чего прекращается синтез РНК.
Третий токсин – Y-экзотоксин - мало изучен. Это пока неидентифицированный фермент (или группа ферментов). Предполагают, что он относится к фосфолипидам. Еще не доказано, что Y-экзотоксин действительно токсичен.
Четвертый токсин - Q-эндотоксин, или параспоральный кристаллический эндотоксин, образуется одновременно со спорой в противоположной части бактерии. Вначале он имеет форму бесформенного комочка, постепенно превращающегося в правильный восьмигранник. У большинства разновидностей Вас. thuringiensis образование споры и кристалла сопровождается распадом стенки клетки, в результате споры и кристаллы освобождаются и раздельно поступают в культуральную среду. Кристаллы по своему химическому строению представляют собой белковое соединение, в состав которого входят 17,5% азота и почти отсутствует фосфор. Структурная целостность кристалла обусловливается, видимо, связями белка с кремнием. Кристаллический белок по химической природе очень сходен с белком оболочки споры. Наиболее вероятно предположение, что кристалл образуется в результате перепроизводства белка в оболочке споры. Кристаллы слабоустойчивы к действию температуры. Прогревание при температуре 80-100 °С в течение 30-40 мин разрушает его структуру и инактивирует токсические свойства. В связи с этим Q-эндотоксин часто называют термолабильным. Белок кристалла переходит в раствор при высокой щелочности среды (pH 11,0-12.5). В кишечнике чешуекрылых, для которого характерен высокий pH, в щелочной среде токсичные компоненты кристалла высвобождаются.
Ферменты насекомого превращают протоксин кристалла в непосредственно действующий настоящий токсин. Разница в восприимчивости различных видов насекомых к действию кристалла связана со специфичностью кишечных протеаз, контролирующих гидролиз кристаллов in vivo. Этими протеазами обладают не все насекомые, с чем и связана избирательность действия токсина.
Типичными симптомами действия кристаллического эндотоксина на восприимчивых насекомых являются паралич кишечника, прекращение питания в течение нескольких минут после заглатывания токсина и развитие общего паралича, приводящего к гибели насекомого.
В настоящее время известно 12 серотипов и 15 вариантов этого вида эндотоксина, принадлежащего к группе кристаллоносных бактерий. Из них наибольшее практическое значение для получения бактериальных препаратов имеют следующие варианты: тюрингиензис, или берлинер, относящийся к I, алести - к III, дендролимус - к IV и галлерия - к V серотипам. Следует еще раз подчеркнуть, что характерная особенность кристаллоносных бактерий - образование помимо эндоспор параспоральных белковых кристаллов.
Образование споры у видов группы Bacillus thuringiensis происходит после интенсивного роста культуры. Она формируется вблизи одного из концов тела и выходит наружу. У различных вариантов бактерий наблюдаются некоторые различия во времени образования спор. В высушенном состоянии при комнатной температуре споры сохраняются без существенных изменений в течение 10 лет и более. При высокой влажности споры погибают при температуре 100 °С через 5-10 мин. Споры, проглоченные восприимчивым хозяином, прорастают в его кишечнике. Вегетативные клетки проникают в полость тела, где они быстро размножаются, разрушают определенные ткани и вскоре заполняют значительную часть полости. Данная стадия заражения носит название септицимии. Бактерии этой группы могут уничтожить 130 видов насекомых, в том числе вредителей полевых, овощных, плодовых культур, виноградников и леса. Самый высокий эффект получают при использовании Вас. thuringiensis против листогрызущих вредителей.
Характеристика бактериальных препаратов
Промышленность, используя способность различных штаммов Вас. thuringiensis образовывать токсичные вещества, споры и кристаллы, выпускает на этой основе различные бактериальные препараты (табл. 7.1).
Энтобактерин предложен ВНИИ защиты растений, создан на основе Вас. thuringiensis var. galleriae. Может выпускаться в виде порошка, жидкости в смеси с прилипателем 2-05 и в виде пасты.
Инсектин предложен Красноярским институтом леса СО АН СССР, создан на основе спор и кристаллов Вас. thuringiensis var. insectus.
Алестин создан во ВНИИбакпрепарате на основе спор и кристаллов третьего серотипа var. alesti. Может выпускаться в виде порошка или стабилизированной пасты.
Экзотоксин создан во ВНИИбакпрепарате на основе культуральной жидкости Вас. thuringiensis var. insectus. Выпускается в виде порошка с содержанием 3,3% экзотоксина.
Гоксобактерин получен на основе спор, кристаллов и экзотоксина Вас. thuringiensis var. insectus. Представляет собой смачивающийся порошок влажностью 5% в смеси с прилипателем 4-10, содержит 30 млрд. спор и кристаллов и 0,025 г экзотоксина в 1 г.
Дендробациллин предложен Иркутским университетом, создан на основе спор и кристаллов Вас. thuringiensis var. dendrolimus. Представляет собой смачивающийся порошок с титром не менее 30 млрд. жизнеспособных спор в 1 г.
Битоксибациллин, или БТБ-202, создан во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Состоит из спор и метаболитов Bac. thuringiensis var thuringiensis. Препарат готовят двумя способами: распылительной сушкой культуральной жидкости; сепарированием культуральной жидкости до получения пасты и последующим выпариванием фугата, объединением пасты с концентрированным фугатом и лиофильной сушкой смеси. Последний способ дает возможность регулировать количество экзотоксина в готовом препарате. В 1 г препарата содержится 30 млрд. спор и кристаллов.
Технология производства бактериальных препаратов
Всякое производство микробных патогенов на основе энтомопатогенных бактерий предусматривает глубинное культивирование с целью достижения максимального титра клеток в культуральной жидкости или накопления токсина. Затем споры и кристаллы отделяют сепарированием для дальнейшего обезвоживания. До последнего времени основной формой выпускаемых микробиологической промышленностью бактериальных энтомопатогенных препаратов являлись смачивающие порошки. Эта форма хорошо зарекомендовала себя, т. к. она удобна при транспортировке и хранении. Однако при производстве значительное время требуется на процессы сушки, помола, стандартизации и фасовки. При приготовлении водных суспензий они долго набухают и после перемешивания быстро оседают на дно емкостей. Это приводит к забиванию распыляющих устройств. В настоящее время наиболее перспективной формой бактериальных препаратов считается стабилизированная паста. Ее производство в значительной степени позволило упростить и удешевить технологию производства вследствие ликвидации процессов сушки и помола.
Бактериальный патоген в форме стабилизированной пасты представляет собой вязкую жидкость консистенции густой сметаны, кремового или светло-серого цвета, однородную по составу, не распыляющуюся и не замерзающую при хранении, без резкого или неприятного запаха, не подвергающуюся гниению или брожению.
Технологию производства бактериальных энтомопатогенных препаратов возможно проиллюстрировать на примере энтобактерина. Схема производства энтобактерина приведена ниже.
Технология производства энтобактерина предусматривает все последовательные стадии, характерные для любого микробиологического производства, основанного на глубинном культивировании микроорганизмов: выращивание посевного материала в лаборатории, выращивание посевного материала в аппарате, выращивание культуры в ферментаторе, концентрирование культуральной жидкости, сушка пасты, усреднение и фасовка препарата.
Для успешного производства бактериальных препаратов в промышленности используют штаммы, отвечающие следующим требованиям: принадлежность к определенному серотипу, высокая вирулентность, высокая продуктивность на промышленных средах, средняя чувствительность к комплексу фагов, сохранение активности в технологическом процессе, отсутствие токсичности для теплокровных животных и человека, эффективность применения.
Энтобактерин готовят на основе споровой энтомопатогенной культуры Bac. thuringiensis var. gallerie. В лаборатории завода производственный штамм Bac. thuringiensis var. galleriae рассевают на твердую среду мясопептонный агар (МПА). Культура контролируется на чистоту, отсутствие фага, продуктивность и вирулентность культуральной жидкости.
В начальной стадии приготовления посевного материала культуру выращивают в конических колбах на 3 л. На всех стадиях производства для выращивания бактерий используют дрожжеполисахаридную среду (ДПС) следующего состава (в %): кормовые дрожжи 2-3, кукурузная мука 1-1,5, кашалотовый жир до 1. При выращивании культуры в посевном аппарате засев стерильной среды осуществляют посевным материалом, полученным в лаборатории в количестве 0,05 % от объема засеваемой среды (титр посевного материала не менее 1,7*10 в 9 степени спор в 1 мл). Рост культуры длится 35-40 ч при непрерывном перемешивании и аэрации (0,2 л/л среды в минуту), температуре 28-30 °С и избыточном давлении в аппарате 40-50 кПа.
При использовании полученного посевного материала для засева питательной среды в ферментаторе среду проверяют на наличие посторонней микрофлоры и фага. Посевной материал, выращенный в течение 35-40 ч, представляет собой споровую культуру, которая устойчива в течение контрольного времени хранения.
Если ранее рекомендовали устанавливать pH питательной среды раствором щелочи до 7,8-8,2, то в последнее время считают целесообразным оставлять pH естественным после добавления компонентов (6,2-6,4). Непрерывная стерилизация питательной среды проводится при температуре 140-145 °С, и, если поддерживается слабощелочная реакция среды, это приводит к разрушению витаминов группы В.
Количество посевного материала для засева питательной среды ферментатора составляет 0,0012% при титре 1,7*10 в 9 степени спор в 1 мл. Выращивание культуры в ферментаторе ведется в течение 35-40 ч при тех же технологических параметрах процесса, что и в посевном аппарате. Процесс заканчивается тогда, когда в культуральной жидкости содержится не менее 5-10% свободных спор и кристаллов от их общего количества, при этом титр культуры должен составлять не менее 1 млрд. спор в 1 мл. Готовую культуральную жидкость передают в предварительно простерилизованные сборники. К концу выращивания значение pH находится в пределах 8,0-8,5. При такой щелочной реакции кристаллы частично дробятся на более мелкие. Это приводит к выносу их с фугатом в канализацию, что ведет к некоторой потере активности. Для предотвращения этого целесообразно перед сепарацией снижать pH культуральной жидкости до 6,0-6,2.
При сепарировании выход пасты с 1 м3 культуральной жидкости составляет около 100 кг при влажности 85% и титре порядка 20 млрд. спор в 1 г. В процессе сепарирования происходит дальнейшее освобождение спор и кристаллов от клеточных оболочек. Собранную в сборнике пасту перемешивают в течение 30 мин, после чего отбирают пробу на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага. Фугат может быть вторично использован для приготовления питательной среды. Длительное использование фугата невозможно, т. к. происходит накопление веществ, которые после 3-4 циклов культивирования тормозят развитие культуры, в результате происходит значительное снижение титра и заспорованности.
Последующее использование фугата также возможно, но только для выращивания дрожжей. Многократное использование фугата не только сокращает промышленные стоки и снижает расход воды, но и приводит к значительной экономии сырья.
После проверки паста подается на распылительную сушку. Температура воздуха на входе в сушильную камеру 120 °С; на выходе 50 °С. Из сушилки поступает продукт влажностью не более 10%. Выход сухого продукта с 1 м3 культуральной жидкости 12-13 кг с титром 100-150 млрд. спор в 1 г.
Усреднение препарата проводят каолином, доводя в смесителе титр готового продукта до 30 млрд. спор в 1 г. Готовый энтобактерин фасуют по 20 кг в четырехслойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем и маркируют. При производстве стабилизированной пасты после сепарации стабилизация проводится путем внесения в пасту карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Имея высокую сорбционную способность, молекулы КМЦ в период смешивания со спорокристаллическим комплексом сорбируют белковые кристаллы и споры и заряжают их отрицательно. В результате нативные частицы препарата располагаются на равном расстоянии одна от другой, образуя так называемую трехмерную сетчатую структуру в пасте. Такое расположение частиц позволяет консервантам в равной степени проникать между ними, обеспечивая препаратам длительную сохранность.
Одним из «узких мест» в технологии производства энтобактерина, как и других бактериальных препаратов, остается борьба с фаголизисом культур Bacillus thuringiensis. Ряд исследователей считает, что существует обратная зависимость между вирулентностью и фагоустойчивостью штаммов, и высказывает предположение о невозможности сочетания этих свойств в одном штамме в связи с образованием токсина по принципу фаговой конверсии. Так, устойчивые к фагу культуры (var. berliner) не образовывали кристаллов ни при поверхностном, ни при глубинном культивировании.
Механизм действия фага, как принято считать, связан с прекращением синтеза ДНК в бактерии-хозяине. Однако считают, что одним из путей борьбы с фаголизисом является получение фагоустойчивых штаммов. В Институте микробиологии АН Армянской ССР селекционированы фагоустойчивые штаммы Bac. thuringiensis, которые отнесены к новой разновидности var. caucasicus. На их основе получены препараты БИП-805, БИП-811 и БИП-837, по спектру и характеру действия близкие к энтобактерину. Экспериментально показана возможность блокирования развития фага путем добавления к культуре различных соединений (антифаговых факторов): B-пропиолактона, препаратов нуклеиновых кислот, N-лаурол-L-валина, N-пальмитол-L-глутамата и др. Все перечисленные соединения ввиду сложности получения и высокой стоимости не находят в настоящее время широкого применения.
По-видимому, кроме селекционных приемов для повышения устойчивости к фагам необходимо регулярно производить смену штаммов и препаратов, что даст возможность избежать фаголизиса в производстве.
В соответствии с ГОСТ 21108-75 готовый препарат энтобактерин содержит в 1 г не менее 30 млрд. спор бактерий и примерно столько же белковых кристаллов эндотоксина, влажность не более 5%. Препарат предназначен для борьбы с насекомыми - вредителями садовых, огородных и парковых культур. В настоящее время выявлено более 60 видов насекомых, в борьбе с которыми энтобактерин эффективен.
Энтобактерин применяется путем опрыскивания растений, зараженных вредителями, 0,5-1%-ной водной суспензией в период активного питания вредителя. В значительной степени эффективность препарата зависит от температуры. Чем выше температура в момент применения и в последующие 1-2 сут, тем выше эффективность энтобактерина и тем скорее наступает гибель насекомых. Обычно основная масса вредителей погибает за 2-10 сут.
С целью повышения эффективности применения энтомопатогенных препаратов в их состав или в водные разбавители добавляют специальные вещества, предназначенные для поддержания всех ингредиентов препаратов в форме однородной суспензии: антииспарители, снижающие испарение жидкости прежде, чем она достигнет поверхности растения; смачиватели, способствующие формированию устойчивой поверхности раздела жидкость-твердое тело; прилипатели, повышающие стойкость пленки препарата к внешним воздействиям среды (дождя, росы); защитные вещества, уменьшающие воздействие солнечного излучения на споры и кристаллы.
Важно, чтобы эти соединения не стимулировали преждевременное прорастание или рост и не препятствовали успешному закреплению патогена. Развивается направление по использованию бактериальных препаратов в виде приманок. С этой целью в препарат добавляют различные привлекающие насекомых вещества, что приводит к повышению поедаемости листьев растения, обработанного энтомопатогенным препаратом.