Выявление кишечной палочки, аэробов и анаэробов в консервном сырье

Выявление кишечной палочки

Для выявления в сырье кишечной палочки (мясо, рыба) после отбора проб из полученных смывов по 1 мл высевают в пробирки с 9 мл разведенной глюкозо-пептонной среды или с 5 мл разведенной среды Булира. Засеянные пробирки выдерживают в термостате 24 ч при 43 °С. Из помутневших пробирок (с газообразованием или без газообразования) производят посев петлей на дифференциально-диагностическую среду Эндо в чашки Петри.

Можно и непосредственно во время отбора проб мяса или рыбы дополнительно вырезать из глубины мышц из различных мест туши кусочки объемом 2-3 см3 и отрезанными кусочками засеять поверхность застывшей среды Эндо в чашках Петри. Посевы на среде Эндо как в первом, так и во втором случае выдерживают в термостате 24 ч при 37°С. При наличии кишечной палочки в исследуемой пробе на поверхности среды Эндо вырастают типичные, ярко-красные с металлическим блеском, выпуклые, слизистые колонии.

Определение кишечной палочки при исследовании сырья дает более полное представление о санитарных условиях его транспортировки и хранения. В некоторых случаях, например при исследовании рыбы, наличие кишечной палочки указывает на происшедшее фекальное загрязнение и всегда свидетельствует о неудовлетворительном санитарном состоянии производства. При бациллоносительстве с фекальными загрязнениями могут попасть патогенные бактерии.

Однако для доказательства факта свежего фекального загрязнения пищевых продуктов необходимо дифференцировать типичную для фекальных нечистот подгруппу Escherichia coli commune от типичной для почвенных бактерий подгруппы Escherichia coli aerogenes. Для этого необходимо провести нитратную пробу на среде Симмонса.

Посев штрихом на среду Симмонса производят из колонии, подозрительной на кишечную палочку, со среды Эндо. Проверяют не менее 3-4 различающихся по виду колоний. Посевы выдерживают в термостате 24-48 ч при 37 °С. Культуры кишечной палочки, способные сбраживать среду Эйкмана (или Булира) при 43 °С, не растущие на среде Симмонса, заслуживают особого внимания как показатели свежего фекального загрязнения продукта. Микробы подгруппы Е. coli аёrogenes всегда растут на среде Симмонса, но не вызывают газообразования в среде Эйкмана, поэтому обнаружение микробов подгруппы Е. coli аёrogenes не может служить доказательством непосредственного фекального загрязнения продукта.

Примечание. Согласно имеющимся литературным данным, выловленная в незагрязненных водоемах рыба в своем кишечнике не содержит кишечной палочки. Загрязнение кишечника рыб этими бактериями связано с местами обитания человека. Выделяемые из кишечника рыб микробы и группы кишечной палочки почти всегда относятся к подгруппе Escherichia coli аёrogenes (цитратположительных), способных усваивать лимоннокислый натрий как источник углерода; микроорганизмы же группы Escherichia coli commune и другие разновидности группы фекального происхождения Escherichia paracoli не способны его утилизировать.

Выявление спор аэробных микробов

Число спор в исследуемом сырье при технологических операциях (например, до и после мойки и пр.) определяется в 1 мл смыва при посеве прогретого материала в чашки Петри с мясопептонным агаром. Из полученных при отборе проб смывов стерильной трубкой или пипеткой отбирается в стерильную пробирку примерно 10 мл смывной воды. Пробирка с отобранным смывом помещается на водяную баню с температурой 50 °С и прогревается до кипения (что соответствует 98 °С в пробирке с материалом). Из прогретой жидкости 1 мл высевают в чашку Петри, заливая расплавленным и охлажденным до 45 °С мясопептонным агаром. Посев помещают в термостат на 24 ч при 37 °С. После инкубации посева проводят подсчет колоний. Количество колоний, выросших на чашке, показывает число спор аэробных микробов во взятой пробе.

Выявление облигатных анаэробов (метод выявления анаэробов в смешанных культурах)

Чтобы установить присутствие облигатных анаэробов в сырье (или в каких-либо других продуктах), из смывов, полученных при отборе проб, производится посев 1 мл в чашку Петри с питательным агаром «под стекло». Этот метод был разработан лабораторией Центрального научно-исследовательского института консервной и овощесушильной промышленности (ЦНИИКОП) на основе метода, предложенного Дол Векшио Витторио для выявления анаэробов в смешанных культурах.

Посев 1 мл смывной жидкости в чашке Петри заливают 20 мл расплавленного и охлажденного до 45°С мясопептонного агара с 1% глюкозы. Немедленно после застывания среды на ее поверхность пинцетом (асептически) накладывают прогретое на пламени горелки, но не горячее стерильное предметное стекло и слегка прижимают его к поверхности агара. Стекло должно быть наложено так, чтобы под ним не было пузырьков воздуха. Если воздушные пузырьки под стеклом все же образуются, то их следует удалить, передвигая стекло по поверхности агара. После наложения стекла чашка перевертывается крышкой вниз и ставится в таком виде в термостат с температурой 37 °С на 24 ч.

Облигатные анаэробы выявляются на чашке под стеклом в центральной его части в виде отдельных колоний или сплошного роста на расстоянии на 3-8 мм от края стекла, образуя иногда под стеклом пузырьки газа.

Если в посевном материале содержались факультативные анаэробы, то рост отмечается по всей поверхности агара в чашке и под всей поверхностью стекла. Если же в посевах присутствуют только аэробы, наблюдается обильный рост по всей поверхности агара в чашке и полное отсутствие роста под стеклом. При наличии в посевах аэробной микрофлоры и облигатных анаэробов рост аэробов наблюдается по всей поверхности агара в чашке, а анаэробов - только под стеклом в центральной его части.

Метод Вейона для культивирования анаэробов

Метод культивирования в трубках Вейона обычно применяется для выделения чистых культур анаэробов. В качестве питательной среды для этой цели применяют полужидкий агар (см. «Приготовление питательных сред»). На полужидком агаре колонии анаэробов вырастают быстрее, чем на твердом.

Для выращивания анаэробов методом Вейона необходимо иметь стеклянные трубочки длиной 30 см и внутренним диаметром 4-6 мм. Один конец трубки оттягивают и запаивают, как у пастеровской пипетки, а второй оплавляют и закрывают ватой. Перед употреблением трубки стерилизуют.

Полужидкий агар для трубок Вейона готовится в пробирках по 10 мл в каждой; перед посевом среда предварительно прогревается при 100 °С в течение 15-20 мин и охлаждается до 50 °С. Посев в трубки Вейона производится следующим образом. 1 мл исследуемого материала вносят в пробирку с 10 мл расплавленного и охлажденного агара. Быстрым вращательным движением пробирки между ладонями смешивают содержимое пробирки. Получают первое разведение. 1 мл из этой пробирки переносят в следующую пробирку (второе разведение). Остатком агара от первого разведения наполняют трубку Вейона. Для этого оттянутый конец трубки обламывают пинцетом над пламенем горелки, погружают в пробирку почти до самого дна и через свободный конец трубки, не вынимая из него ватной пробки, насасывают агар на 3Д высоты трубки. После наполнения оттянутый конец трубки вновь запаивают. То же повторяют со второй, третьей и последующими пробирками, засевая 4-5 убывающих разведений. Из каждого разведения наполняют по одной трубке. Трубки нужно отметить номерами в порядке их наполнения от первого разведения к последующим. Заполненные и запаянные трубки охлаждают и ставят в термостат при температуре 37 °С. Через 2-3 дня в трубках, засеянных большими разведениями, можно наблюдать отдельные колонии, а также разрыв столбика агара в нескольких местах вследствие возникновения газа при развитии анаэробов.

В трубках, засеянных малыми разведениями материала, разрыв агара иногда бывает настолько большим, что из трубок выталкиваются ватные пробки. Из, трубок, где засеяны большие разведения, можно выделить чистую культуру. Верхний слой агара в трубках, приблизительно на расстоянии 1-2 см от поверхности, остается свободным от роста микробов (мертвая зона), так как из-за происшедшей аэрации в момент посева анаэробы в этом слое не растут.

После термостатирования трубки просматривают и выбирают одну из них с изолированными колониями. Оттянутый конец трубки осторожно обламывают пинцетом и содержимое трубки выдувают в чашку Петри. Намеченные колонии с помощью петли или пастеровской пипетки пересевают по одной в пробирки со средой Китта-Тароцци для выделения чистой культуры анаэробов, которые идентифицируют. При наличии соответствующих разведений метод Вейона можно применить и для количественного учета анаэробов. При необходимости подсчета колоний в трубках Вейона пользуются формулой

где r - внутренний радиус трубки; h - высота слоя агара в ней; a - разведение; n - число колоний в трубке; 10 - объем агара в трубке, равный 10 мл, в который производился посев 1 мл исследуемого материала.