Определение азотистых соединений
При исследовании некоторых процессов пищеконцентратного и овощесушильного производства и при установлении пищевой ценности готовой продукции определяют азотистые соединения (белок, аминокислоты и др.). Методы определения общего азота основаны на проведении окисления исследуемого вещества концентрированной серной кислотой при нагревании.
После полного окисления исследуемого материала проводят количественное определение аммиака, разлагая образовавшуюся аммонийную соль [(NH4)2SO4] раствором едкого натра при нагревании. Аммиак отгоняют в титрованный раствор кислоты, где вновь образуется аммонийная соль по реакции (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 + H2O. Избыток кислоты оттитровывают и определяют количество азота.
Для определения общего количества азота в продукте применяют макрометод Кьельдаля. В некоторых случаях пользуются полумикрометодом или микрометодом.
Определение общего азота по макрометоду Кьельдаля
Навеску измельченного исследуемого вещества берут в пробирку с точностью до 0,0001 г в таком количестве, чтобы в ней содержалось азота от 20 до 40 мг. Пробирку с навеской вводят в горло колбы Кьельдаля емкостью 250 мл и осторожно высыпают. При этом следят, чтобы частицы вещества не попали на горло колбы. После этого опорожненную пробирку снова взвешивают и по разности устанавливают величину навески. Жидкие продукты перед окислением навески серной кислотой выпаривают на слабом огне до сиропообразного состояния.
Для сжигания материала в колбу Кьельдаля с навеской приливают осторожно частями химически чистую серную кислоту (относительной плотностью 1,84) из расчета не менее 10 мл на 1 г вещества. При внесении серной кислоты содержимое колбы перемешивают. Чтобы ускорить сжигание, в колбу Кьельдаля после приливания серной кислоты добавляют небольшое количество катализатора (окись меди, металлический селен, перекись водорода, сернокислый калий и др.). Затем горло колбы закрывают стеклянной пробкой грушеобразной формы, колбу помещают в наклонном положении на сетке над газовой горелкой в вытяжном шкафу.
Вначале содержимое колбы нагревают медленно до разжижения обуглившейся массы. Затем нагрев усиливают настолько, чтобы горло колбы, по которому стекают конденсированные пары серной кислоты, не нагревалось. По окончании окислительного разложения жидкость в колбе становится прозрачной. Процесс сжигания продолжается 3-3,5 ч.
По окончании сжигания содержимое колбы Кьельдаля охлаждают, разбавляют дистиллированной водой и переносят в перегонную колбу емкостью 500 мл, установленную на асбестовой сетке над горелкой. Колбу Кьельдаля ополаскивают несколько раз (5-6) дистиллированной водой, сливая ее в перегонную колбу. Общий объем жидкости в перегонной колбе составляет 150-200 мл. Перегонную колбу соединяют через каплеуловитель с холодильником, а последний с приемной колбой (коническая колба емкостью 250 мл), в которую предварительно приливают 20-30 мл 0,1 н. раствора серной кислоты с 2-3 каплями индикатора и погружают кончик холодильника в раствор кислоты. В качестве индикатора применяют метиловый красный, метиловый оранжевый или комбинированный индикатор (0,1 метилового синего и 0,2 г метилового красного в 200 мл 96%-ного спирта).
В перегонную колбу приливают осторожно по стенкам колбы 33-35%-ный раствор едкого натра (35-40 мл на 10 мл серной кислоты) для разложения (NH4)2SO4 и бросают несколько кусочков металлического цинка, пемзы или стеклянные капилляры, чтобы жидкость равномерно кипела. После этого содержимое перегонной колбы осторожно перемешивают круговыми движениями, зажигают горелку под колбой и нагревают жидкость в колбе до кипения, которое продолжается до тех пор, пока не будет отогнан весь аммиак. Через 10-15 мин после начала кипения, по прекращении выделения газообразного аммиака, отводную трубку холодильника вынимают из раствора кислоты и продолжают отгонку.
Конец отгонки устанавливают по пробе капли отгона на лакмусовую бумагу, которая при этом не должна синеть, и по объему отогнанной жидкости около 100 мл. По окончании перегонки отводную трубку холодильника споласкивают дистиллированной водой и оттитровывают избыток серной кислоты 0,1 н. раствором едкого натра.
Количество кислоты, связанной с аммиаком, находят по разности между количеством кислоты, взятой в приемник, и кислотой оттитрованной. Для определения азота число миллилитров 0,1 н. раствора серной кислоты, связанной с аммиаком, умножают на 0,0014 (1 мл 0,1 и. раствора серной кислоты соответствует 0,0014 г азота). Найденное количество азота выражают в процентах по массе (весу) вещества, взятого для исследования.
Содержание азота в процентах (x) в продукте рассчитывают по формуле
где V - количество 0,1 н. серной кислоты, вступившей в соединение с аммиаком, мл; g - навеска вещества, г.
Для пересчета содержания азота на белок полученное количество азота умножают на коэффициент, соответствующий исследуемому продукту.
Определение общего азота по полумикрометоду Кьельдаля
Наиболее удобным является видоизмененный макрометод Кьельдаля. Он отличается от последнего тем, что для сжигания берут меньшую навеску (в ней должно содержаться азота 5 мг) либо используют для отгона аммиака часть смеси, полученной после сжигания навески, взятой так же, как и при определении азота по макрометоду.
Методика определения. Навеску исследуемого вещества сжигают так же, как при определении азота макрометодом. После сжигания навески аммиак отгоняют в специальном приборе (рис. 20). Он состоит из парообразователя 1, который представляет собой колбу, наполненную дистиллированной водой (наливают через воронку); предохранительной трубки 2 с зажимами 7 и 8; колбы Кьельдаля 3, предназначенной для отгона, с опущенной в нее стеклянной трубкой; воронки с зажимом, через которую наливают 33%-ный едкий натр; трубки, посредством которой предохранительная трубка соединяется с парообразователем; холодильника 4 (длина 40-45 см); каплеуловителя 5; приемной колбы Эрленмейера 6 (емкостью 250 мл). После обработки навески серной кислотой содержимое колбы для отгона аммиака переносят в колбу 3 прибора.
Если берут большую навеску, то сожженную смесь переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки и для отгона берут в отгонную колбу Кьельдаля несколько миллилитров (10-20) в зависимости от содержания азота в полученном растворе. Перед началом отгона в приемную колбу 6, как в макрометоде, помещают титрованный раствор серной кислоты с индикатором и соединяют ее с холодильником 4.
До переноса исследуемого раствора в отгонную колбу вода в парообразователе должна быть доведена до кипения при открытом зажиме 7 у предохранительной трубки и закрытом зажиме 8 к перегонной колбе. Для равномерного кипения воды в колбу (парообразователь) помещают капилляры или пемзу. После соединения отгонной колбы 3 (содержащей исследуемый раствор) с прибором через воронку наливают 15 мл дистиллированной воды с 1-2 каплями индикатора - метилрота. Затем через эту воронку приливают 33%-ный раствор едкого натра из расчета на 1 мл крепкой серной кислоты 5 мл раствора едкого натра (о щелочной реакции содержимого колбы судят по находящемуся в нем индикатору). После этого быстро закрывают зажим на воронке, последовательно открывают зажим 8 на предохранительной трубке и закрывают зажим 7. Пар, находящийся в парообразователе, поступает в колбу Кьельдаля и происходит отгонка аммиака. Для ускорения отгонки содержимое отгонной колбы слегка подогревают, но не доводят до бурного кипения во избежание возможного попадания капель щелочи в насадку. Отгон аммиака заканчивают после увеличения объема жидкости в приемной колбе в 2,5-3 раза.
Дальнейшие операции и расчет содержания азота в продукте проводят, так же как и при определении макрометодом.
Определение белкового азота
Для определения белка установленное количество азота пересчитывают на определенный коэффициент (см. выше) или белковый азот определяют специальными методами.
Методика определения. (Метод по Бернштейну - Штуцеру) основан на том, что белки отделяют от остальных веществ исследуемого продукта в виде осадка, а затем в осадке определяют азот по методу Кьельдаля. Определив белковый азот и отдельно общий азот, находят по разности небелковый азот.
Навеску хорошо измельченного исследуемого продукта берут в количестве 1-2 г, переносят в коническую колбу, прибавляют 50 мл дистиллированной воды и нагревают до кипения. При наличии в исследуемом веществе значительного количества крахмала навеску предварительно нагревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 40-50° С. Затем в колбу прибавляют 25 мл раствора сернокислой меди (60 г в 1 л воды) и при помешивании 25 мл раствора едкого натра (12,5 г в 1 л воды). При этом образуется гидрат окиси меди, который осаждает белки. После отстаивания жидкость сливают через фильтр, промывают осадок в колбе несколько раз горячей дистиллированной водой, сливая каждый раз воду через тот же фильтр. Затем осадок переносят на фильтр, промывают колбу и осадок на фильтре теплой водой до исчезновения реакции промывных вод на ионы Cu2+ (проба с K4Fe(CN)6 либо SO4- (проба с ВаСl2).
Осадок вместе с фильтром высушивают и определяют в нем содержание азота по методу Кьельдаля. Полученное количество азота умножают на коэффициент, соответствующий исследуемому продукту, и устанавливают содержание белка в продукте.
Определение аминного азота
Аминокислоты и пептиды способны образовывать растворимые медные соединения с суспензией фосфорнокислой меди в боратном буфере. Избыток фосфата меди отфильтровывают и в растворе после прибавления уксусной кислоты и йодистого калия определяют медь йодометрическим методом.
Методика определения аминного азота. Навеску продукта в количестве 4-5 г, взятую с точностью до 0,0001 г, количественно переносят в мерную колбу емкостью 250 мл и добавляют 100-150 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и выдерживают 15-20 мин при частом взбалтывании. Затем содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр в сухую колбу. Берут пипеткой 10 мл фильтрата и переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, прибавляют 4-5 капель раствора тимолфталеина (индикатор) и затем по каплям 1 н. раствор едкого натра до слабо-синей окраски. Затем приливают мерным цилиндром 20 мл суспензий фосфорнокислой меди. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, хорошо перемешивают и центрифугируют или фильтруют через плотный складчатый фильтр; раствор должен быть абсолютно прозрачным, так как присутствующая в виде мути фосфорнокислая медь искажает результаты последующего титрования.
5 мл полученного прозрачного фильтрата переносят пипеткой в колбу, подкисляют 0,5 мл 80%-ной уксусной кислоты, добавляют около 0,4 г йодистого калия, 0,5 мл 1%-ного крахмального клейстера (индикатор) и оттитровывают выделившийся йод 0,01 н. раствором гипосульфита из микробюретки (до обесцвечивания).
Содержание аминного азота в процентах (х) вычисляют по формуле
где V - количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшее на титрование, мл; К - поправка 0,01 н. раствора гипосульфита; g - навеска исследуемого продукта, г; 0,28 - количество аминного азота, соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора гипосульфита, мг.
Приготовление реактивов
1. Раствор хлорной меди. 27,3 г реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды.
2. Трехзамещенный фосфат натрия. 64,5 г реактива растворяют в 500 мл прокипяченной дистиллированной воды, свободной от углекислоты, добавляют 7,2 г едкого натра, растворяют и доводят водой до 1 л.
3. Боратный буфер. 57,21 г буры растворяют в 1,5 л дистиллированной воды, добавляют 100 мл 1 н. раствора соляной кислоты и доводят водой до 2 л.
4. Суспензия фосфорнокислой меди. Один объем раствора хлорной меди добавляют к двумя объемам раствора фосфата натрия и хорошо смешивают. Затем добавляют два объема буферной смеси и снова смешивают. Суспензия может храниться 2-3 дня.
5. Раствор тимолфталеина. 0,25 г реактива растворяют в 100 мл 50%-ного этилового спирта.
6. 0,01 н. раствор гипосульфита готовят перед проведением анализа соответствующим разбавлением 0,1 н. раствора гипосульфита.